（一）適用范圍

本操作說(shuō)明適用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等凍存細(xì)胞的復(fù)蘇操作過(guò)程。

（二）主要試劑

復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有20%滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，復(fù)蘇1管細(xì)胞用量為30mL。

注：10%-20%滅活FBS均可，推薦20%滅活FBS。

IMDM，DMEM，MEM培養(yǎng)基均可，推薦RPMI-1640培養(yǎng)基。

（三）儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋、生物安全柜（超凈工作臺(tái)）、離心機(jī)。

注：如無(wú)恒溫水浴鍋，用溫度37±3℃溫水亦可。

（四）復(fù)蘇操作流程

打開(kāi)恒溫水浴鍋，水溫設(shè)置為37℃。

將復(fù)蘇培養(yǎng)基孵育至37℃，在生物安全柜內(nèi)，取9 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基15 mL離心管。

從液氮罐或超低溫冰箱取出凍存管，用鉗子夾住凍存管蓋子邊緣，迅速放入37°C水浴中均勻快速的水平搖晃（勿將管蓋浸入水中），直至凍存管中冰晶完全融解，停止水?。s90s-120s，確定完全融解后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移）。

用75%酒精擦拭凍存管表面以及蓋子，在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)凍存管，并把凍存管內(nèi)溶液用移液器轉(zhuǎn)移到裝有9 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基的15 mL離心管內(nèi)（轉(zhuǎn)移時(shí)吸取和打出液體要輕柔緩慢，15s均勻吸取/打出1mL細(xì)胞懸液）。

吸取1 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基洗滌凍存管，再將洗滌液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，按以上步驟重復(fù)洗滌凍存管一次。輕輕吹打5-7次混勻細(xì)胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。

離心后，棄上清，加入復(fù)蘇培養(yǎng)基至10mL，輕輕吹打重懸細(xì)胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。

離心后，棄上清，吸去殘留液體，加入復(fù)蘇培養(yǎng)基（根據(jù)計(jì)數(shù)需要計(jì)算加入復(fù)蘇培養(yǎng)基的體積，如用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，推薦重懸濃度5-10M/mL），輕輕吹打重懸細(xì)胞，避免氣泡。

對(duì)重懸均勻的細(xì)胞懸液進(jìn)行數(shù)量和活率測(cè)定。

（五）復(fù)蘇注意事項(xiàng)

為避免細(xì)胞損失太大，復(fù)蘇過(guò)程盡可能使用15mL離心管。

如果儲(chǔ)存凍存細(xì)胞的設(shè)備距離水浴較遠(yuǎn)，應(yīng)用干冰進(jìn)行轉(zhuǎn)移，避免凍存細(xì)胞在室溫中暴露太久。

融解搖晃過(guò)程中，不可將凍存管管蓋浸入水中，以免水進(jìn)入管中，造成污染。

水浴后不可顛倒或傾斜凍存管，以免造成細(xì)胞損失。

細(xì)胞水浴過(guò)程操作要穩(wěn)定快速，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到離心管以及吹打時(shí)操作要輕柔緩慢，切勿快速吹打剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞。

減少棄上清后的液體殘留，以保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，但去上清時(shí)不可吸到管底細(xì)胞。

復(fù)蘇后細(xì)胞會(huì)在一個(gè)小時(shí)左右恢復(fù)到最佳狀態(tài)，如需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行損傷性處理，請(qǐng)等待細(xì)胞活性達(dá)到最佳后進(jìn)行。

如需將細(xì)胞放置較長(zhǎng)時(shí)間才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則加入復(fù)蘇培養(yǎng)基至10mL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置或搖床上震蕩。

應(yīng)按本說(shuō)明進(jìn)行復(fù)蘇操作，且復(fù)蘇操作過(guò)程不能有時(shí)間停頓，以保證細(xì)胞活性。